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    4mL DNA 離心超濾管 (30-50 KD)操作步驟

    更新時(shí)間:2023-06-07      點(diǎn)擊次數(shù):1163

    4mL DNA 離心超濾管 (30-50 KD)操作步驟

    切取含有目的DNA 片段的瓊脂糖凝膠條帶。

       ● 盡量切除不含有目的DNA 部分的凝膠,減少凝膠體積,提高DNA 回收率。

       ● 切膠時(shí),請(qǐng)使用長(zhǎng)波長(zhǎng)UV  (360 nm )光盒。且不要將DNA 長(zhǎng)時(shí)間暴露在紫外燈下,以防DNA 損傷。

    2  稱取凝膠的重量近似地確定其體積。

       ● 凝膠重量的稱量方法:取.5 ml 離心管電子天平稱初質(zhì)量,切膠裝在離心管后稱終質(zhì)量,兩者差即為膠的質(zhì)量。不同離心管的重量可能有差異,因此,每個(gè)離心管的重量需單獨(dú)稱量。

    3  按照每00 mg 瓊脂糖凝膠對(duì)應(yīng)00 µl 溶液BD 的比例,向離心管中加入溶液BD。

    4  50 ℃水浴7-0min,直至凝膠*溶化。期間需要振蕩混合3 次。

       ● 瓊脂糖必須*融化,以免堵塞柱子,嚴(yán)重影響DNA 段的回收效率。

       ● 如果總體積大于500 µl,可適當(dāng)增加溶膠時(shí)間。

       ● 若此時(shí)溶液變紅,可加0 µl 3M NaAC  (pH 5.2)。

    5  將步驟4 所獲溶液置于DNA 純化柱中,靜置2min 。

       ● 膠塊*溶解后將膠溶液溫度降至室溫再上柱,因?yàn)榧兓谳^高溫度時(shí)結(jié)合DNA  的能力較弱。

    6  2,000 rpm 離心min。若溶液量大于DNA 純化柱的容積,可分兩次離心,棄濾液。

       ● 此時(shí)DNA 被吸附于DNA 純化柱中的硅膠膜上。

    7  加入500 µl 溶液BD。2,000 rpm,  離心min,棄濾液

    8  加入500 µl 溶液PE。2,000 rpm,  離心min,棄濾液。

       ● 溶液PE 初次使用前用無水乙醇按: 4 稀釋,即含80% 乙醇。

       ● 此步驟的作用是將硅膠膜上吸附的蛋白、鹽等雜質(zhì)洗脫,以獲得高質(zhì)量DNA 段。

    9  加入500 µl 溶液PE。2,000 rpm,  離心min,棄濾液。

    0 2,000 rpm 離心  3min ,以*去除純化柱中的液體。

       ● 此步驟的作用是去除殘留乙醇,避免殘留乙醇影響后續(xù)酶促反應(yīng)。同時(shí)也利于DNA 段的充分溶解。

      將離心柱置于新的.5 ml 離心管中。向純化柱的處,懸空滴加30-00 µl 溶液Eluent  (60℃預(yù)熱),靜置2min 。2,000 rpm  離心min,管底即為目的DNA 段。貯存于-20℃。

       ● 溶液Eluent 可用無菌雙蒸水代替,但其pH 需為8.0-8.5,加入體積視DNA 目的段的多少、用戶對(duì)目的濃度要求而定。

       ● 對(duì)溶液Eluent 60℃預(yù)熱,會(huì)提高提取DNA 目的段的產(chǎn)量。

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